PCR

Prometo seguir con los usos de las enzimas de restricción, pero primero quiero explicaros la PCR, pues una técnica muy importante y en muchos casos se usa en lugar de las enzimas... Es una de las técnicas más usadas en biología molecular y se usa para amplificar fragmentos concretos de ADN u obtener más cantidad de ADN cuando tenemos muy poco. PCR son las siglas de Polymerase Chain Reaction (Reaccion en cadena de la Polimerasa). Se llama así porque se basa principalmente en la acción de esta enzima, la polimerasa. La DNA polimerasa es una enzima que, basicamente, lo que hace es crear cadenas de ADN. Pero no lo hace al azar, lo que hace es, usando una cadena de ADN (una cadena sóla, no la doble hélice) va creando la cadena complementaria. Para ello también necesita que primero halla un fragmentito de doble cadena, lo que como vereis nos va a ser muy útil. La enzima más usada es la Taq-Polimerasa, llamada así porque se extrae de una bacteria llamada Thermus aquaticus (que, como su nombre indica, vive en aguas calientes), y que es capaz de funcionar a una alta temperatura (sobre 70ºC) y soportar sin degradarse temperaturas aún mayores. Vale, os explico por qué nos resulta útil que necesite un fragmentito de doble hélice. Si nosotros tenemos un ADN (en doble hélice) y lo sometemos a calor (más de 90ºC, que nadie se asuste), lo que hacemos es desnaturalizarlo (es decir, separar las dos cadenas). Una vez que las tenemos separadas, si bajamos la temperatura las cadenas volveran a unirse, pero si por ahí tenemos unas pequeñas cadenitas complementarias se unirán antes, porque hay menos bases (letras) que aparear. Antes de seguir aquí quiero hacer un inciso, pues aunque para algunos puede ser claro no se si todo el mundo lo sabe; cuando las bases aparean lo hacen de una forma concreta, de modo que las Cs sólo se unen con las Gs y las As sólo se unen con las Ts, por esto es por lo que se habla de cadena complementaria, porque para una secuencia AACT la complementaria (que pondremos justo debajo) será TTGA. De modo que cuándo antes he dicho que la polimerasa coge una cadena como molde para hacer otra lo que hace es que si ve una T pone una A, si ve una A pone una T, si ve una G pone una C y si ve una C pone una A. Una vez aclarado esto (lo siento por los que ya lo supieran) sigo con los fragmentitos. Estos pequeños fragmentos los ponemos nosotros, y se llaman cebadores o primers. Tienen unas 20 bases y se pueden pedir a las empresas con la secuencia que nosotros queramos. Los ponemos en la mezcla y al bajar la temperatura se unirán al ADN que teníamos allí dónde encuentren la secuencia complementaria. De ese modo tenemos una gran molécula de ADN de cadena simple (el que no está en doble hélice) y una pequeña parte de doble cadena. La polimerasa reconocerá esto y se unirá ahí, empezando a formar más cadena complementaria a la que teníamos (también quiero aclarar que la polimerasa sólo crea cadena en una determinada dirección, de manera que sabemos hacia dónde va a crear la nueva cadena. Así que poniendo un primer en cada dirección podemos delimitar la región que queremos amplificar. De esta forma, usando un aparato que llamamos Termociclador, sometemos el ADN a distintas temperaturas para que la cadena se desnaturalice, se unan los primers y luego actúe la polimerasa. Luego otra vez se desnaturaliza, se unen los primers y actúa la polimerasa.... Por eso el aparato se llama termociclador, porque usa ciclos de temperatura. Así obtenemos la misma cadena muchas más veces (aumenta exponencialmente con el número de ciclos) y además sólo de la región que queremos (porque la primera ronda puede que amplifique más, pero luego se va a restirngir a nuestra zona) Este es un vídeo muy bonito que he encontrado en el Youtube sobre la PCR, pero allí podeis encontrar muchos mas, incluido este que tiene los subtítulos en castellano. Me había planteado haceros un vídeo, pero habiendolos tan buenos en la red creo que es tontería, porque seguro que a mi me queda peor... Espero que os haya quedado claro, si no no dudeis en preguntar. Otro día os explico aplicaciones que si no me va a quedar un post muy largo... Lo que si os quiero poner es este vídeo de BioRad... para que veais lo importante que es para nosotros la PCR que le han hecho una canción...